Verfügbarkeit: Etablierung des CRISPR/Cas-Systems am Modellorganismus des Hühnerembryos am Beispiel der Herunterregulation der Expression des Pleiotrophingens

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Bibliographische Detailangaben
Titel:	Etablierung des CRISPR/Cas-Systems am Modellorganismus des Hühnerembryos am Beispiel der Herunterregulation der Expression des Pleiotrophingens
Von:	vorgelegt von Mathias Müller aus Langenfeld (Rheinland)
Person:	Müller, Mathias 1991- Verfasser aut
Hauptverfasser:	Müller, Mathias 1991- (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
Sprache:	Deutsch
Veröffentlicht:	Köln [2021]
Schlagworte:	Medullarrohr Elektroporation Sonde > Medizinisches Gerät Immuncytochemie Plasmid Hochschulschrift
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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS ...................................................................................................... 6 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS ........................................................................................... 9 ABBILDUNGSVERZEICHNIS .......................................................................................... 11 TABELLENVERZEICHNIS ................................................................................................. 13 I EINLEITUNG ............................................................................................................... 14 1. PLEIOTROPHIN ........................................................................................................ 14 1.1 GEEIGNETE MODELLORGANISMEN FUER IN VIVO ELEKTROPORATIONSVERSUCHE........... 15 1.2 FORSCHUNG AM MODELLORGANISMUS DES HUEHNEREMBRYOS UND GENTRANSFER VIA ELEKTROPORATION .................................................................................................. 16 1.3 STADIENEINTEILUNG NACH HAMBURGER UND HAMILTON (1951) .............................. 17 2. DAS CRISPR/CAS-SYSTEM ................................................................................. 19 2.1 EINSATZGEBIETE DES CRISPR/CAS-SYSTEMS.................................................... 19 2.2 DIE FUNKTIONSWEISE DES CRISPR/CAS-SYSTEMS ............................................ 20 2.2.1 GRUNDSAETZLICHER ABLAUF DES CRISPR/CAS-ABWEHRMECHANISMUS .............. 20 2.2.2 DIE ROLLE DER ZELLEIGENEN REPARATURMECHANISMEN BEIM EINSATZ DES CRISPR/CAS-SYSTEMS ......................................................................................... 23 2.3 DAS CRISPR/CAS-SYSTEM BEIM HUEHNEREMBRYO ........................................ 23 3. WISSENSCHAFTLICHE FRAGESTELLUNG ....................................................................... 24 II. MATERIAL & METHODEN ....................................................................................... 25 1. MATERIAL .............................................................................................................. 25 1.1 GERAETE ............................................................................................................. 25 1.2 REAGENZLISTE ................................................................................................... 26 1.3 VERWENDETE ANTIBIOTIKA ................................................................................... 28 1.4 LOESUNGEN ........................................................................................................ 28 1.4.1 ANSAETZE FUER LOESUNGEN DER WHOLE MOUNT IN SITU HYBRIDISIERUNG .................. 28 1.5 VERWENDETE ANTIKOERPER ................................................................................... 31 1.6 SOFTWARE & IT-PROGRAMME.............................................................................. 31 2. METHODEN ........................................................................................................... 32 2.1 MOLEKULARE METHODEN .................................................................................... 32 2.1.1 TRANSFORMATION ............................................................................................ 32 2.1.2 DNA-PLASMID-PRAEPARATION .......................................................................... 32 2.1.3 SONDENGENERIERUNG .................................................................................... 32 2.1.3.1 KLONIERUNG VON CAS9 ............................................................................... 32 2.1.3.2 PCR-AMPLIFIKATION.................................................................................... 34 2.1.3.3 AUFREINIGUNG DES PCR-PRODUKTES ........................................................... 35 2.1.4 HERSTELLUNG DER GRNA-PLASMIDE .................................................................. 36 2.1.5 HERSTELLUNG DER DNA-PLASMID-GEMISCHE .................................................... 37 2.2 MIKROMANIPULATIONEN VON HUEHNEREMBRYONEN ............................................ 38 2.2.1 INKUBATION DER EMBRYONEN .......................................................................... 38 2.2.2 ELEKTROPORATION ............................................................................................. 39 2.2.3 ISOLIERUNG ..................................................................................................... 40 2.2.4 EINBETTUNG DER EMBRYONEN IN GBS-BLOECKE ................................................ 40 2.2.5 ANFERTIGEN VON VIBRATOMSCHNITTEN ................................................................ 41 2.3 WHOLE-MOUNT IN S/FU-HYBRIDISIERUNG ................................................................ 41 2.3.1 DURCHFUEHRUNG DERWM IN S/FU-HYBRIDISIERUNG .............................................. 42 2.4 IMMUNHISTOCHEMISCHE METHODEN ................................................................... 43 2.4.1 NACHWEIS VON HCAS9 AN VIBRATOMSCHNITTEN ............................................... 44 2.4.1.1 FIXIERUNG IN AGAROSEBLOECKEN ....................................................................44 2.4.1.2 HERSTELLUNG VON VIBRATOMSCHNITTEN .......................................................... 44 2.4.1.3 DURCHFUEHRUNG DERWM IMMUNHISTOCHEMIE MIT HCAS9-ANTIKOERPER ...........45 2.4.2 WHOLE-MOUNT IMMUNHISTOCHEMIE MIT ANTI-GFP-ANTIKOERPER ........................ 46 2.5 DOKUMENTATION ................................................................................................46 III. ERGEBNISSE ........................................................................................................... 47 1. CHARAKTERISIERUNG DES PTN-EXPRESSIONSMUSTERS IM HUEHNEREMBRYO .............. 47 1.1 VERGLEICH DES EXPRESSIONSMUSTERS ZWEIER UNTERSCHIEDLICH GROSSER PTN SONDEN ............................................................................................................... 47 1.2 CHARAKTERISIERUNG DES PTN-EXPRESSIONSMUSTERS IM NEURALROHR ................... 52 1.3 CHARAKTERISIERUNG DES PTN-EXPRESSIONSMUSTERS IN DEN SOMITEN ................. 53 2. GFP-NACHWEIS ................................................................................................... 56 2.1 TRANSFEKTION DER ZELLEN DES NEURALROHRS MITTELS ELEKTROPORATION ................... 56 2.2 ANTI-GFP WHOLE MOUNT IMMUNHISTOCHEMIE NACH IN S/TU-HYBRIDISIERUNGEN....58 3. CAS9-NACHWEIS .................................................................................................. 59 3.1 ANTI-HCAS9 IMMUNHISTOCHEMISCHER NACHWEIS AN FLOTTIERENDEN SCHNITTEN .... 60 3.2 WM ISH MIT SPEZIFISCHER HCAS9-SONDE ........................................................... 62 4. PTN-HERUNTERREGULATION MITTELS CRISPR/CAS9 ................................................ 64 4.1 PTN NACHWEIS IN CRISPR/CAS9 TRANSFIZIERTEN NEURALROHRZELLEN AUF MAKROSKOPISCHER EBENE ..................................................................................... 64 4.1.1 STATISTISCHE AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE ..................................................... 68 4.2 ZUORDNUNG DER GFP-POSITIVEN ZELLEN ZU ENTSPRECHENDEN PTN EXPRESSIONSMUSTEM ANHAND VON VIBRATOMSCHNITTEN ........................................ 69 4.2.1 STATISTISCHE AUSWERTUNG DER VIBRATOMSCHNITTBILDER .................................... 72 4.3 ABSCHLIESSENDE BEWERTUNG UND DIAGRAMME ................................................... 74 4.3.1 VORGEHENSWEISE DER OBJEKTIVEN BEWERTUNG ............................................... 74 4.3.2 UNTERSCHIEDE IN DER FARBINTENSIVITAET DER PTN UND GFP-EXPRESSION ....... 76 IV. DISKUSSION ........................................................................................................... 82 7 1. WICHTIGE FAKTOREN FUER EINE ERFOLGREICHE EXPRESSION VON PTN ......................... 82 1.1 ERFOLGREICHE ETABLIERUNG DER KLEINEREN 232-PTN-SONDE ................................ 82 1.2 VERLUST DES PTN-EXPRESSIONSMUSTERS IM NEURALROHR AB DEM ALTERSSTADIUM HH25 ................................................................................................................. 84 2. DISKUSSION DER TECHNISCHEN ASPEKTE DER VERSUCHSABLAEUFE ............................. 85 2.1 DIE ERFOLGREICHE ELEKTROPORATION VON GFP ALS SCHLUESSELMARKERPROTEIN ........ 85 2.2 NACHWEIS DER EXPRESSION VON HCAS9 IN DEN ZIELZELLEN ................................. 85 2.3 PRINZIPIELLE MACHBARKEIT DER HERUNTERREGULATION VON PTN AUF ZELLEBENE UND IM MODELLORGANISMUS DES HUEHNEREMBRYOS....................................................... 86 2.4 WELCHE WEITEREN NACHWEISMETHODEN GIBT ES? .............................................. 87 2.5 ENTSCHEIDENDE ROLLE VON GRNAS ................................................................... 88 3. ERKLAERUNGSANSATZ FUER DIE VERMEINTLICHE GEGENREGULATION ................................ 89 4. AUSBLICK ............................................................................................................. 90 V. ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................. 92 VI. LITERATURVERZEICHNIS ........................................................................................... 93 VII. ANHANG ............................................................................................................. 100 1 VERWENDETE PRIMER-SEQUENZEN ....................................................................... 100 2 PLASMIDSEQUENZEN ........................................................................................... 102 VIII. LEBENSLAUF ...................................................................................................... 105 8
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