Verfügbarkeit: Epigenetische DNA-Methylierung des HERV-W-Promotors bei abnormaler humaner Plazentogenese und Tumorgenese

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Bibliographische Detailangaben
Titel:	Epigenetische DNA-Methylierung des HERV-W-Promotors bei abnormaler humaner Plazentogenese und Tumorgenese
Von:	vorgelegt von Matthias Rübner
Person:	Rübner, Matthias 1976- Verfasser aut
Hauptverfasser:	Rübner, Matthias 1976- (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Buch
Sprache:	Deutsch
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adam_text	INHALTSVERZEICHNIS ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................ VIII SUMMARY ................................................................................................................... X 1 EINLEITUNG .......................................................................................................... 1 1.1 PLAZENTOGENESE ...................................................................................... 1 1.1.1 UEBERBLICK DER VERSCHIEDENEN PLAZENTATYPEN ............................................................................................... 1 1.1.2 HUMANE PLAZENTOGENESE ............................................................................................................................... 3 1.1.2.1 VON DER OVULATION BIS ZUR GASTRULATION ............................................................................................ 3 1.1.2.2 HUMANE PLAZENTOGENESE .................................................................................................................... 5 1.1.2.3 TROPHOBLASTENDIFFERENZIERUNG - DER VILLOESE TROPHOBLAST ................................................................ 6 1.1.2.4 TROPHOBLASTENDIFFERENZIERUNG - DER SYNCYTIOTROPHOBLAST ............................................................... 7 1.1.2.5 TROPHOBLASTENDIFFERENZIERUNG - DER INTERSTITIELLE EXTRAVILLOESE TROPHOBLAST .................................. 9 1.1.2.6 TROPHOBLASTENDIFFERENZIERUNG - DER ENDOVASKULAERE EXTRAVILLOESE TROPHOBLAST ..............................9 1.2 HUMANE ENDOGENE RETROVIREN ................................................................................................................... 10 1.2.1 PLAZENTASPEZIFISCHE HERVS ........................................................................................................................ 13 1.2.2 NICHT-PLAZENTASPEZIFISCHE HERVS ............................................................................................................. 16 1.3 PLAZENTARE SYNDROME .................................................................................................................................... 17 1.3.1 INTRAUTERINE WACHSTUMSRESTRIKTION ............................................................................................................. 17 1.3.2 PRAEEKLAMPSIE ................................................................................................................................................ 18 1.3.3 HELLP ......................................................................................................................................................... 18 1.3.4 PLAZENTARE SYNDROME UND HERVS ............................................................................................................. 19 1.4 GESTATIONSBEDINGTE TROPHOBLASTENERKRANKUNGEN ................................................................................... 19 1.5 DAS ENDOMETRIALKARZINOM .......................................................................................................................... 20 1.6 ZELLFUSION ....................................................................................................................................................... 22 1.6.1 DER ZELLFUSIONSPROZESS ................................................................................................................................ 22 1.6.2 ZELLFUSIONEN UND HERVS ........................................................................................................................... 23 1.7 EPIGENETIK ...................................................................................................................................................... 25 1.7.1 DNA-METHYLIERUNG ..................................................................................................................................... 26 1.7.2 HISTONMODIFIKATION .....................................................................................................................................29 1.7.3 EPIGENETISCHE REGULATION VON HERVS ......................................................................................................30 2 ZIELSETZUNG ................................................................................................... 32 3 MATERIAL UND METHODEN ............................................................................. 33 3.1 MATERIAL................................................................................................................................................. 33 3.1.1 CHEMIKALIEN, BIOCHEMISCHE REAGENZIEN ................................................................................................... 33 3.1.2 ENZYME UND KITS ......................................................................................................................................... 34 3.1.3 PUFFER UND LOESUNGEN ................................................................................................................................... 35 3.1.4 PHARMAKOLOGISCHE INHIBITOREN UND AKTIVATOREN ........................................................................................37 3.1.5 MEDIEN UND REAGENZIEN FUER DIE ZELLKULTUR ................................................................................................ 37 3.1.6 OLIGONUKLEOTIDE ........................................................................................................................................... 37 3.1.7 PLASMIDE ....................................................................................................................................................... 39 3.1.8 ANTIKOERPER .................................................................................................................................................... 39 3.1.9 ZELLLINIEN ...................................................................................................................................................... 39 3.1.10 E. COLI STAEMME ............................................................................................................................................ 40 3.1.11 GERAETE, SOFTWARE UND SONSTIGE MATERIALIEN ............................................................................................... 40 3.2 METHODEN ....................................................................................................................................................... 41 3.2.1 PATIENTINNEN UND PROBENGEWINNUNG .......................................................................................................... 41 3.2.2 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN ................................................................................................................ 42 3.2.2.1 TRANSFORMATION VON E. COLI ............................................................................................................. 42 3.2.2.2 KULTIVIERUNG UND LAGERUNG VON BAKTERIEN .................................................................................... 42 3.2.2.3 PLASMIDISOLIERUNGEN ........................................................................................................................42 3.2.2.4 RNA EXTRAKTION AUS ZELLEN UND GEWEBEN .................................................................................... 43 3.2.2.5 DNASEL BEHANDLUNG VON RNA ....................................................................................................... 43 3.2.2.6 DNA EXTRAKTION AUS ZELLEN UND GEWEBE ...................................................................................... 44 3.2.2.7 DNA EXTRAKTION AUS AGAROSEGELEN ............................................................................................... 44 3.2.2.8 PHOTOMETRISCHE BESTIMMUNG VON RNA UND DNA KONZENTRATIONEN ........................................... 44 3.2.2.9 REVERSE TRANSKRIPTION ..................................................................................................................... 45 3.2.2.10 SEMIQUANTITATIVE REAL-TIME-PCR .................................................................................................. 45 3.2.2.11 ABSOLUTQUANTITATIVE REAL-TIME-PCR ............................................................................................. 47 3.2.2.12 BISULFITBEHANDLUNG GENOMISCHER DNA .......................................................................................... 48 3.2.2.13 METHYLIERUNGSSPEZIFISCHE PCR .......................................................................................................50 3.2.2.14 STRATACLONING FUER SEQUENZIERUNG .................................................................................................... 51 3.2.2.15 SEQUENZIERUNG ................................................................................................................................. 52 3.2.3 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN .......................................................................................................................... 53 3.2.3.1 KULTIVIERUNG HUMANER CHORIONKARZINOM-ZELLLINIEN JAR, JEG-3 UND BEWO .................................. 53 3.2.3.2 ISOLIERUNG UND KULTIVIERUNG HUMANER TROPHOBLASTEN ................................................................... 53 3.2.3.3 VITALITAETSFAERBUNG VON CT MITTELS TRYPANBLAU ................................................................................ 56 3.2.3.4 FACS ANALYSE ................................................................................................................................. 56 3.2.3.5 PAPPENHEIM FAERBUNG ....................................................................................................................... 57 3.2.3.6 ZELLMEMBRANFAERBUNG ....................................................................................................................... 57 3.2.3.7 EINBETTEN DER PLAZENTAPROBEN IN PARAFFIN ...................................................................................... 58 3.2.3.8 FAST RED FAERBUNG ............................................................................................................................. 58 3.2.3.9 HAEMATOXILIN-EOSIN FAERBUNG ............................................................................................................59 3.2.3.10 BESTIMMUNG DES ZELLFUSIONSINDEX .................................................................................................. 59 3.2.3.11 BESTIMMUNG DER KERNZAHL PRO MM SCT IM PARAFFINSCHNITT .........................................................59 3.2.3.12 BILDAUFNAHME UND BILDBEARBEITUNG ................................................................................................ 60 3.2.4 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN ................................................................................................................60 3.2.4.1 PROTEINEXTRAKTION AUS ZELLEN UND GEWEBEN .................................................................................... 60 3.2.4.2 PROTEINBESTIMMUNG NACH BRADFORD ................................................................................................. 61 3.2.4.3 SDS-POLYACRYLAMID-GELELEKTROPHORESE .......................................................................................... 61 3.2.4.4 WESTERN BLOT ..................................................................................................................................... 62 3.2.4.5 STRIPPEN DER PVDF MEMBRAN .......................................................................................................... 63 3.2.4.6 COOMASSIE FAERBUNG VON PROTEINGELEN ............................................................................................ 63 3.2.4.7 IMMUNFLUORESZENZ VON TROPHOBLASTEN ........................................................................................... 63 3.2.4.8 HCG ELISA ...................................................................................................................................... 64 3.2.4.9 IN VITRO METHYLIERUNG .......................................................................................................................64 3.2.4.10 TRANSFEKTION MIT JETPEI ................................................................................................................... 65 3.2.4.11 LUZIFERASE UND B-GAL GENREPORTER ASSAY ....................................................................................... 65 3.2.5 STATISTISCHE AUSWERTUNG UND DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE ....................................................................... 66 4 ERGEBNISSE ..................................................................................................... 67 4.1 WEITERENTWICKLUNG DER TROPHOBLASTENAUFREINIGUNG ............................................................................. 67 4.2 VERAENDERTES ZELLFUSIONSVERHALTEN KORRELIERT MIT EINER VERMINDERT HERV-HUELLGENE EXPRESSION IN IUGR .............................................................................................................................................................. 71 4.2.1 KLINISCHE DATEN DER UNTERSUCHTEN PATIENTINNENKOHORTE ............................................................................ 71 4.2.2 HERV ENV GENEXPRESSIONSPROFIL IM PLAZENTAGEWEBE ............................................................................. 72 4.2.3 HERV ENV GENEXPRESSIONSPROFIL IN ISOLIERTEN TROPHOBLASTEN ................................................................. 75 4.2.4 VERAENDERTES FUSIONSVERHALTEN IN LUGR-PLAZENTEN .................................................................................... 77 4.2.5 VERAENDERTES FUSIONSVERHALTEN IN ISOLIERTEN IUGR-TROPHOBLASTEN .......................................................... 78 4.3 METHYLIERUNGSPROFIL DER 5 LTR VON HERV-W IN PLAZENTA ................................................................... 80 4.3.1 METHYLIERUNGSSPEZIFISCHE PCR (MSP) ....................................................................................................... 80 4.3.2 SEQUENZIERUNG DER 5 LTR NACH BISULFITBEHANDLUNG - PLAZENTAGEWEBE .................................................. 82 4.3.3 SEQUENZIERUNG DER 5 LTR NACH BISULFITBEHANDLUNG - TROPHOBLASTEN .................................................... 83 4.4 EFFEKTE VON 5 AZA-2-DESOXYCYTIDIN UND TRICHOSTATIN A AUF DIE SYNCYTIN-1 EXPRESSION ................ 84 4.4.1 5 AZA-2-DESOXYCYTIDIN - BEHANDLUNG VON TROPHOBLASTENZELLLINIEN ..................................................... 84 4.4.2 TRICHOSTATIN A - BEHANDLUNG VON TROPHOBLASTENZELLLINIEN ...................................................................... 85 4.4.3 KOMBINIERTE AZA UND TSA BEHANDLUNG VON TROPHOBLASTENZELLLINIEN ............................................... 86 4.4.4 EFFEKTE DER AZA-BEHANDLUNG AUF DEN FUSIONINDEX ................................................................................. 88 4.4.5 HEMMUNG DER SYNCYTIN-1 PROMOTORAKTIVITAET DURCH METHYLIERUNG .......................................................... 89 4.5 GENEXPRESSIONSPROFIL VON METHYLTRANSFERASEN UND METHYLBINDEPROTEINEN IN IUGR UND KONTROLL CTS .................................................................................................................................................................. 91 4.6 METHYLIERUNGSPROFIL VON SYNCYTIN-1 IM ENDOMETRIALKARZINOM ------------------------------------------- 92 5 DISKUSSION ....................................................................................................... 94 5.1 REDUKTION DER HERV-HUELLGEN EXPRESSION KORRELIERT MIT VERMINDERTEN FUSIONSINDEX IN IIJGR. 94 5.1.1 REDUKTION DER HERV-HUELLGEN EXPRESSION IN IUGR .............................................................................. 94 5.1.2 UNVERAENDERTE EXPRESSION DER SYNCYTIN-1 REZEPTOREN ASCT-1 UND ASCT-2 IN IUGR ........................ 99 5.1.3 ABNAHME DER EXPRESSION DES SYNCYTIN-2 REZEPTORS MFSD2 ................................................................ 100 5.1.4 ENVW(XQ22.3) ZEIGTE GERINGE EXPRESSION IN DER PLAZENTA ................................................................... 101 5.2 EPIGENETISCHE REGULATION DER SYNCYTIN-1 EXPRESSION .......................................................................... 102 5.2.1 HYPERMETHYLIERUNG DER 5 LTR VON HERV-W KORRELIERT MIT VERMINDERTEN SYNCYTIN-1 EXPRESSION IN PATHOLOGISCHEN PLAZENTEN ......................................................................................................................... 102 5.2.2 DIE BEHANDLUNG VON ZELLLINIEN MIT 5 AZA-2 DESOXYCYTIDIN ERHOEHT DIE SYNCYTIN-1 EXPRESSION UND DEN FUSIONSINDEX ...................................................................................................................................... 107 5.2.3 SYNCYTIN-2 UND SYNCYTIN-3 MODULIEREN DAS FUSIONSVERHALTEN ............................................................ 109 5.2.4 TRICHOSTATIN A WIRKT INDIREKT AUF DIE GENEXPRESSIONS DER SYNCYTINE ................................................... 111 5.3 UEBEREXPRESSION VON SYNCYTIN-1 IM ENCA KORRELIERTE MIT EINER HYPOMETHYLIERUNG DER 5 LTR VON HERV-W ...................................................................................................................................................... 113 5.4 AUSBLICK 115 6 LITERATURVERZEICHNIS .............................................................................. 117 7 ANHANG ............................................................................................................ 137 7.1 ABKUERZUNGSVERZEICHNIS .............................................................................................................................. 137 7.2 DANKSAGUNG .................................................................................................................................................. 142 7.3 LEBENSLAUF ................................................................................................................................................... 144 7.4 PUBLIKATIONEN .............................................................................................................................................. 145 7.5 KONGRESSBEITRAEGE UND PREISE .................................................................................................................... 145 7.5.1 POSTERPRAESENTATIONEN ...................................................................................................................................... 145 7.5.2 VORTRAEGE .................................................................................................................................................... 146 7.5.3 PREISE ....................................................................................................................................................... 146 7.6 ERKLAERUNG .................................................................................................................................................. 147
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