Verfügbarkeit: Der Einfluss von S-Palmitoylierung auf die pro-apoptotische Aktivität des BCL2-Proteins BAX

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Bibliographische Detailangaben
Titel:	Der Einfluss von S-Palmitoylierung auf die pro-apoptotische Aktivität des BCL2-Proteins BAX
Von:	vorgelegt von Michael Fröhlich
Person:	Fröhlich, Michael 1984- Verfasser aut
Hauptverfasser:	Fröhlich, Michael 1984- (VerfasserIn)
Format:	Abschlussarbeit Mikrofilm Buch
Sprache:	Deutsch
Veröffentlicht:	2013
Ausgabe:	[Mikrofiche-Ausg.]
Schlagworte:	Hochschulschrift
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adam_text	INHALT 1 EINLEITUNG 1.1 PROGRAMMIERTER ZELLTOD UND APOPTOSE 1 1.1.1 EXTRINSISCHER SIGNALWEG DER APOPTOSE 3 1.1.2 INTRINSISCHER SIGNALWEG DER APOPTOSE 4 1.1.3 MITOCHONDRIEN UND APOPTOSE 6 1.1.4 CASPASEN ALS EFFEKTOREN DER APOPTOSE 7 1.2 BCL2-PROTEINE ALS REGULATOREN MITOCHONDRIALER APOPTOSE 9 1.2.1 DAS ANTI-APOPTOTISCHE PROTEIN BCL-X L 10 1.2.2 BH3-ONLY PROTEINE 13 1.3 BAX - DAS BCL2 ASSOCIATED X PROTEIN 14 1.3.1 STRUKTUR-FUNKTIONSANALYSE VON BAX 15 1.3.2 REGULATION DER AKTIVITAET VON BAX 21 1.4 POST-TRANSLATIONALE MODIFIKATIONEN AN CYSTEINEN 22 1.4.1 DHHC-PROTEINE UND PALMITOYLIERUNG 23 1.4.2 DYNAMISCHE PALMITOYLIERUNG UND INTRAZELLULAERE DISTRIBUTION VON PROTEINEN 25 1.4.3 NITROSYLIERUNG 26 1.5 ZIEL DER ARBEIT 28 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN 29 2.1.1 KLONIERUNG 29 2.1.2 PLASMIDISOLATION 29 2.1.3 RESTRIKTION 30 2.1.4 POLYMERASEKETTENREAKTION 30 2.1.5 KOLONIE-PCR 30 2.1.6 INSERTION VON PUNKTMUTATIONEN VIA FUSIONS-PCR 31 2.1.7 ERSTSTRANG CDNA-SYNTHESE UND AMPLIFIKATION VON BCL-X L 32 2.1.8 KLONIERUNG EINES CHIMAEREN BAX-BCL-X L -GENS VIA FUSIONS-PCR 33 2.1.9 GELELEKTROPHORESE UND GELELUTION 33 2.2 BAKTERIENKULTIVIERUNG 34 2.2.1 KULTIVIERUNG VON ESCHERICHIA COLI 34 2.2.2 HERSTELLUNG KOMPETENTER ESCHERICHIA COLI 35 I HTTP://D-NB.INFO/1043030441 DISSERTATION MICHAEL FROEHLICH INHALTSVERZEICHNIS 2.2.3 TRANSFORMATION VON BAKTERIEN 35 2.3 ZELLKULTUREN 36 2.3.1 KULTIVIERUNG VON SAEUGETIERZELLEN 36 2.3.2 KULTIVIERUNG VON INSEKTENZELLEN 37 2.3.3 BESTIMMUNG DER ZELLZAHL 38 2.3.4 ERSTELLUNG VON CRYO-KULTUREN 38 2.3.5 TRANSFEKTION VON SAEUGETIERZELLEN 39 2.3.6 TRANSFEKTION VON SF9-ZELLEN UND VIRUSAMPLIFIKATION 40 2.3.7 ETABLIERUNG STABIL EXPRIMIERENDER ZELLLINIEN 41 2.4 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN 42 2.4.1 AFFINITAETSCHROMATOGRAPHIE VIA NICKEL-NTA 42 2.4.2 GELPERMEATIONSCHROMATOGRAPHIE 43 2.4.3 ANIONENAUSTAUSCHER 44 2.4.4 PUFFERAUSTAUSCH BEI PROTEINLOESUNGEN 45 2.4.5 ANALYSE DER OLIGOMERISIERUNG VON PROTEINEN 45 2.4.6 SODIUMDODECYLSULFAT-POLYACRYLAMIDGELELEKTROPHORESE (SDS-PAGE) 46 2.4.7 SILBERNITRAT-FAERBUNG 47 2.4.8 WESTERN BLOTTING UND IMMUNODETEKTION 47 2.4.9 MEMBRAN STRIPPING 48 2.4.10 CO-IMMUNOPRAEZIPITATION 49 2.4.11 PALMITOYLIERUNGSNACHWEIS MITTELS TRITIUM-MARKIERTER PALMITINSAEURE 50 2.5 ZELLBIOLOGISCHE METHODEN 51 2.5.1 ANREICHERUNG DER MITOCHONDRIEN AUS KULTIVIERTEN SAEUGETIERZELLEN 51 2.5.2 ISOLATION REINER MITOCHONDRIEN AUS ORGANEN UND SAEUGETIERZELLEN 52 2.5.3 CASPASE 3 ASSAY 53 2.5.4 MTT-ASSAY 54 2.5.5 APOPTOSE-INDUKTION 54 2.5.6 ACYL-BIOTIN-EXCHANGE (ABE) ASSAY / BIOTIN-SWITCH ASSAY 55 2.5.7 INKUBATION VON KULTIVIERTEN SAEUGERZELLEN MIT PALMITINSAEURE 56 2.5.8 INHIBITION VON PALMITOYL-ACYLTRANSFERASEN UND THIOESTERASEN 57 2.5.9 BESTIMMUNG DER PROTEINKONZENTRATION NACH BRADFORD 57 2.6 MIKROSKOPIE 57 2.6.1 IMMUNFLUORESZENZ-FAERBUNG 57 2.6.2 FAERBUNG VON ORGANELLE UND ZELLKOMPARTIMENTEN 58 2.7 STATISTIK 59 2.8 MATERIAL 59 DISSERTATION MICHAEL FROEHLICH INHALTSVERZEICHNIS 2.8.1 CHEMIKALIEN, MEDIEN, ENZYME 59 2.8.2 VERBRAUCHSMATERIAL 59 3 ERGEBNISSE 3.1 IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER PALMITOYLIERUNG VON BAX 60 3.1.1 ANALYSE VON ENDOGENEM BAX AUF DAS VORHANDENSEIN EINER LIPIDMODIFIKATION 60 3.1.2 ANALYSE DER PALMITOYLIERUNG VON BAX IN SF9-ZELLEN 62 3.1.3 DYNAMIK DER BAX PALMITOYLIERUNG 63 3.1.4 INTRAZELLULAERE LOKALISIERUNG VON PALMITOYLIERTEM BAX 65 3.1.5 ISOLATION VON MITOCHONDRIEN UNTERTHIOESTER-HYDROLYSIERENDEN BEDINGUNGEN 69 3.2 PALMITOYLIERUNG UND DIE PRO-APOPTOTISCHE FUNKTION VON BAX 70 3.2.1 IDENTIFIKATION DES PALMITOYLIERTEN CYSTEIN-RESTES 70 3.2.2 CHARAKTERISIERUNG DER UEBEREXPRESSION VON BAX IN VITRO 71 3.2.3 ZELLULAERE ANALYSE DER STADIEN GFP-BAX-INDUZIERTER APOPTOSE 74 3.2.4 UEBEREXPRESSION VON GFP-BAX IN BAX~ / ~ HCT116-ZELLEN 75 3.2.5 LOKALISIERUNG GFP-GETAGGTER BAX CYSTEIN-VARIANTEN 77 3.2.6 ANALYSE DER ASSOZIATION DER CYSTEIN-VARIANTEN VON BAX MIT MITOCHONDRIEN 79 3.2.7 ANALYSE DER OLIGOMERISIERUNG DER BAX CYSTEIN-VARIANTEN 80 3.2.8 CASPASE 3 - AKTIVITAET NACH EXPRESSION VERSCHIEDENER BAX-VARIANTEN 81 3.2.9 QUANTIFIZIERUNG VON APOPTOSEKOERPERCHEN 82 3.3 FUNKTIONSANALYSE DER BH3-DOMAENE IN BAX C62S 84 3.3.1 ANALYSE DER CO-LOKALISIERUNG VON BCL-X L MIT DEN BAX CYSTEIN-VARIANTEN 84 3.3.2 ANALYSE DER INTERAKTION VON BCL-X L MIT DEN BAX CYSTEIN-VARIANTEN 86 3.3.3 ANALYSE DER SUBSTITUTION VON SERIN 60 DURCH CYSTEIN IN DER BH3-DOMAENE 87 3.3.4 IDENTIFIZIERUNG EINER NITROSYLIERUNG AN CYSTEIN 62 VON BAX 88 3.4 ANALYSE EINES CHIMAEREN BAX-BCL-X L PROTEINS 91 3.4.1 GENERIERUNG EINES CHIMAEREN BAX-BCL-X L PROTEINS 91 3.4.2 ANALYSE VON CHIMERA AUF PALMITOYLIERUNG 92 3.5 MODIFIKATION UND REGULATION VON BAX DURCH DHHC-PROTEINE 94 3.5.1 IDENTIFIZIERUNG VON BAX PALMITOYLIERENDEN DHHC PROTEINEN 94 3.5.2 LOKALISIERUNG DER BAX PALMITOYLIERENDEN DHHC PROTEINE 96 3.5.3 KORRELATION ZWISCHEN DER BAX PALMITOYLIERUNG UND INDUKTION DER APOPTOSE 98 III DISSERTATION MICHAEL FROEHLICH INHALTSVERZEICHNIS 4 DISKUSSION 4.1 IDENTIFIZIERUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER PALMITOYLIERUNG VON BAX 100 4.1.1 IDENTIFIZIERUNG VON LIPID-MODIFIZIERTEM BAX 100 4.1.2 DYNAMIK DER BAX PALMITOYLIERUNG 103 4.1.3 INTRAZELLULAERE LOKALISIERUNG VON PALMITOYLIERTEM BAX 104 4.2 PALMITOYLIERUNG UND DIE PRO-APOPTOTISCHE FUNKTION VON BAX 107 4.2.1 IDENTIFIKATION DES PALMITOYLIERTEN CYSTEIN-RESTES 107 4.2.2 CHARAKTERISIERUNG DER UEBEREXPRESSION VON BAX IN VITRO 110 4.2.3 CHARAKTERISIERUNG DER CYSTEIN-VARIANTEN VON BAX 113 4.3 FUNKTIONSANALYSE DER BH3-DOMAENE IN BAX C62S 118 4.4 MODIFIKATION UND REGULATION VON BAX DURCH DHHC-PROTEINE 122 4.4.1 IDENTIFIZIERUNG UND ANALYSE BAX PALMITOYLIERENDER DHHC-PROTEINE 122 4.4.2 KORRELATION ZWISCHEN DER BAX PALMITOYLIERUNG UND INDUKTION DER APOPTOSE 125 5 ANHANG 6 LITERATURVERZEICHNIS IV
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