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| Titel: | Phänotypische Charakterisierung Xin- und Xirp2- doppelt-defizienter Mäuse Untersuchung der Herz- und Skelettmuskulatur |
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| Von: |
vorgelegt von Julia Schuld
|
| Person: |
Schuld, Julia
Verfasser aut |
| Hauptverfasser: | |
| Format: | Abschlussarbeit Buch |
| Sprache: | Deutsch |
| Veröffentlicht: |
Bonn
[2016]
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ABBILDUNGSVERZEICHNIS.................................................................................................................
XI
TABELLEN
VERZEICHNIS..................................................................................................................
XVIII
ABKUERZUNGSVERZEICHNIS...............................................................................................................
XX
1. EINLEITUNG
...............
1
1.1 DIE
SKELETTMUSKULATUR....................................................................................................1
1.1.1 DIE ANATOMIE DES
SKELETTMUSKELS............................................................................1
1.1.2 AUFBAU DER SKELETTMUSKELFASERN
.............................................................................
2
1.1.3 KONTRAKTIONSMECHANISMUS DES SKELETTMUSKELS
......................................................
6
1.1.4
SKELETTMUSKELFASERTYPEN...........................................................................................
7
1.1.5 ENTWICKLUNG DER
SKELETTMUSKULATUR.......................................................................11
1.1.6 SKELETTMUSKELREGENERATION UND
-REMODELLIERUNG..................................................13
1.1.7 STRUKTURANPASSUNGEN DES SKELETTMUSKELS (PLASTIZITAET)
.........................................
16
1.1.7.1 GROESSEN VERAENDERUNG DER SKELETTMUSKELFASEM
(HYPERTROPHIE UND A
TROPHIE)..........................................................................16
1.1.7.2 UMWANDLUNG DES SKELETTMUSKELFASERTYPS (FASERTYPTRANSFORMATION)
.........
18
1.1.8 SPEZIALISIERTE ZELL/MATRIX-VERBINDUNGEN DER MUSKELFASERN
................................
18
1.1.8.1 MUSKEL/SEHNEN-VERBINDUNGEN
(MTJS)...........................................................19
1.1.8.2
COSTAMERE.........................................................................................................20
1.2 DIE
HERZMUSKULATUR......................................................................................................21
1.2.1 DIE ANATOMIE DES
HERZENS......................................................................................21
1.2.2 AUFBAU DER
KARDIOMYOZYTEN...................................................................................22
1.2.3 KONTRAKTIONSZYKLUS DES
HERZMUSKELS...................................................................
24
1.2.4 ANPASSUNGSMECHANISMEN DER
HERZMUSKULATUR......................................................24
1.2.5 SPEZIALISIERTE ZELL/ZELL-VERBINDUNGEN DER KARDIOMYOZYTEN
................................
26
1.2.5.1 GLANZSTREIFEN
(ICDS).........................................................................................26
1.2.5.2
COSTAMERE........................................................................................................
27
1.3 AKTIN-BINDENDE XIN-REPEAT ENTHALTENDE PROTEINE
(XIRPS)........................................27
1.3.1 XIRP-BINDUNGSPARTNER FILAMIN C
..........................................................................33
1.3.2
XIRP-MAUSMODELLE.................................................................................................35
1.3.2.1 XIRPL-KNOCKOUT
MAUSMODELLE..........................................................................35
1.3.2.2 XIRPL-KNOCKOUT BZW. -KNOCKDOWN MAUSMODELLE
...........................................
38
1.4 ZIELSTELLUNG DIESER A
RBEIT..............................................................................................
40
2. MATERIAL UND
METHODEN.......................................................................................................42
2.1 VERWENDETE
MATERIALIEN................................................................................................
42
2.1.1 CHEMIKALIEN, VERBRAUCHSMATERIALIEN UND K ITS
....................................................
42
2.1.2
ANTIKOERPER...............................................................................................................
42
2.1.2.1
PRIMAERANTIKOERPER..............................................................................................
42
2.1.2.2
SEKUNDAERANTIKOERPER..........................................................................................
42
2.1.3 G
ERAETE.......................................................................................................................45
2.1.4
MAUSSTAEMME............................................................................................................
48
2.1.4.1 MAUSMODELL DER
AORTENKONSTRIKTION...............................................................48
2.1.5 PUFFER UND
STAMMLOESUNGEN.....................................................................................49
2.2 VERWENDETE M
ETHODEN..................................................................................................49
2.2.1
PRAEPARATIONSTECHNIKEN.............................................................................................
49
2.2.1.1 ENTNAHME DES HERZENS UND PRAEPARATION DER
ATRIEN UND VENTRIKEL
.......................................................................................
50
2.2.1.2 ENTNAHME DER SKELETTMUSKELN M. SOLEUS,
M. TIBIALIS ANTERIOR UND M.
DIAPHRAGMA........................................................51
2.2.1.3 PRAEPARATION DER
TIBIA........................................................................................
52
2.2.1.4 PRAEPARATION ISOLIERTER
KARDIOMYOZYTEN.........................................................
53
2.2.2 ERFASSUNG UND VERGLEICH ALLGEMEINER KOERPERPARAMETER
......................................
56
2.2.3 KRYOPRAEPARATION DER
GEWEBEPROBEN.....................................................................56
2.2.3.1 KRYOPRAEPARATION FUER DIE LICHTMIKROSKOPISCHE UNTERSUCHUNG
........................
56
2.2.3.2 KRYOPRAEPARATION FUER BIOCHEMISCHE
UNTERSUCHUNG.........................................57
2.2.4 HISTOLOGISCHE, HISTOCHEMISCHE UND IMMUNHISTOLOGISCHE M ETHODEN
..................
57
2.2.4.1 ANFERTIGUNG VON
GEFRIERSCHNITTEN...................................................................57
2.2.4.2 FIXIERUNG VON GEFRIERSCHNITTEN UND ZELLEN
...................................................
58
2.2.4.3 HISTOLOGISCHE
FAERBUNGEN................................................................................59
2.2.4.4 KORRELATION VON FASERFLAECHE UND SDH-INTENSITAET
..........................................
61
2.2.4.5 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZMARKIERUNGEN VON GEWEBE
SCHNITTEN UND
ZELLEN........................................................................................
62
2.2.4.6 INDIREKTE IMMUNFLUORESZENZMARKIERUNG UND ANALYSE
VON
MUSKELFASERTYPEN.....................................................................................
63
2.2.5 MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
...........................................................................
65
2.2.5.1 ISOLIERUNG VON DNA AUS
MAUSSCHWANZSPITZEN.............................................65
2.2.5.2 GENOTYPISIERUNG DER MAEUSE MITTELS POLYMERASE-
KETTENREAKTION
(PCR)......................................................................................65
2.2.5.3 AGAROSEGELELEKTROPHORESE
...............................................................................
67
2.2.6 BIOCHEMISCHE M
ETHODEN........................................................................................
68
2.2.6.1 HERSTELLUNG VON
GEWEBELYSATEN......................................................................
68
2.2.6.2 FRAKTIONIERUNG VON
GEWEBELYSATEN................................................................69
2.2.6.3 DISKONTINUIERLICHE SDS-POLYACRYLAMIDGELELELEKTOPHORESE
(SDS-PAGE)....................................................................................................70
2.2.6.4 PROTEINTRANSFER
.................................................................................................
71
2.2.6.5
PROTEINNACHWEIS..............................................................................................
72
22.6.6 QUALITATIVE CHEMILUMINESZENZ-BASIERTE PROTEINDETEKTION 73
22.6.1 QUANTITATIVE FLUORESZENZ-BASIERTE
PROTEINDETEKTION.....................................74
2.2.6.8 QUANTITATIVE AUSWERTUNG DER BANDENINTENSITAETEN
..........................................
76
2.2.7 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPISCHE M ETHODEN
...........................................
77
2.2.7.1 EINBETTUNG DER GEWEBEPROBEN IN KUNSTHARZ
.................................................
77
2.2.12 ANFERTIGUNG VON
SEMIDUENNSCHNITTEN..............................................................
78
2.2.7.3 ANFERTIGUNG VON
ULTRADUENNSCHNITTEN..............................................................
79
2.2.7.4 NACHKONTRASTIERUNG DER ULTRADUENNSCHNITTE
....................................................
79
2.2.8
LICHTMIKROSKOPIE....................................................................................................
80
2.2.8.1
DURCHLICHTMIKROSKOPIE....................................................................................
80
2.2.8.2
KONFOKALE-LASER-SCANNING-MIKROSKOPIE........................................................80
2.2.8.3
KONFOKALE-SPINNING-DISK-MIKROSKOPIE.........................................................80
2.2.9
ELEKTRONENMIKROSKOPIE...........................................................................................81
2.2.9.1 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPIE (T E M )
...............................................
81
2.2.9.2
RASTERELEKTRONENMIKROSKOPIE..........................................................................81
2.2.10 STATISTISCHE AUSWERTUNG
.........................................................................................
82
3.
ERGEBNISSE............................................................................................................................
83
3.1 ANALYSE DER XIRPS IN DER MUSKULATUR DER WILDTYP-MAUS
........................................
83
3.1.1 EXPRESSION DER X IR
PS.............................................................................................83
3.1.2 SUBZELLULAERE LOKALISATION DER XIRPS
....................................................................
85
3.2 VERIFIZIERUNG DES GENOTYPS DER
VERSUCHSTIERE...........................................................88
3.2.1 GENOTYPISIERUNG DER WILDTYP- UND XIRPL/XIRP2KO/KD-MAEUSE
..................................
88
3.2.2 EXPRESSION DER XIRPS IN MUSKELLYSATEN DER WILDTYP- UND
XIRPL/XIRP2KO/KD-MAE XSC............................................................................................89
3.2.3 BESTIMMUNG ALLGEMEINER
KOERPERPARAMETER..........................................................93
3.2.4 ERMITTLUNG DES
KOERPERGEWICHTS..............................................................................93
3.2.5 ERMITTLUNG DES
HERZGEWICHTS.................................................................................
94
3.2.6 BESTIMMUNG DES VERHAELTNISSES VON HERZ- ZU KOERPERGEWICHT
3.2.7 ERMITTLUNG DES GEWICHTS DES M. TIBIALIS ANTERIOR UND DES M. SOLEUS
.................
97
3.3 PHAENOTYPISIERUNG DER SKELETTMUSKULATUR
..................................................................
100
3.3.1 HISTOLOGISCHE UND HISTOCHEMISCHE FAERBUNGEN DER
SKELETTMUSKULATUR..................................................................................................
100
3.3.1.1 HAEMATOXYLIN-EOSIN FAERBUNG AN KRYOSCHNITTEN DES
M. TIBIALIS ANTERIOR UND DES M. SOLEUS
.......................................................
101
3.3.1.2 SUCCINAT-DEHYDROGENASE-AKTIVITAETS FAERBUNG DES
M. TIBIALIS ANTERIOR UND M.
SOLEUS..............................................................108
3.3.2 IMMUNFLUORESZENZMARKIERUNGEN AN KRYOLAENGSSCHNITTEN DES
M. TIBIALIS ANTERIOR UND
M. SOLEUS ZUR ANALYSE DES MYOFIBRIHAEREN APPARATS ..112
3.3.2.1 LOKALISATION SARKOMERISCHER
PROTEINE.......................................................... 113
3.3.2.2 LOKALISATION VON XIRP-INTERAKTIONSPARTNEM UND
MT J-KOMPONENTEN
...........................................................
115
3.3.3 EXPRESSIONSANALYSE SARKOMERISCHER PROTEINE SOWIE
XIRP
INTERAKTIONSPARTNER.....................................................................................
119
3.3.4 MORPHOMETRISCHE ANALYSE DER SKELETTMUSKELFASERTYPEN AN
KRYOQUERSCHNITTEN DES M. TIBIALIS ANTERIOR UND M. SOLEUS
.................................
123
3.3.4.1 LOKALISATION VON FILAMIN C
..........................................................................142
3.3.5 TRANSMISSIONSELEKTRONENMIKROSKOPISCHE ANALYSE DER
ULTRASTRUKTUR DES M. SOLEUS UND M. TIBIALIS ANTERIOR
..........................................
146
3.4 PHAENOTYPISIERUNG DER
HERZMUSKULATUR.......................................................................152
3.4.1 HISTOLOGISCHE FAERBUNG DER
HERZMUSKULATUR........................................................
152
3.4.2 IMMUNFLUORESZENZMARKIERUNGEN AN HERZKRYOSCHNITTEN ZUR
ANALYSE DES MYOFIBRILLAEREN APPARATS
..................................................................
155
3.4.2.1 LOKALISATION SARKOMERISCHER
PROTEINE.......................................................... 156
3.4.2.2 LOKALISATION VON XIRP-INTERAKTIONSPARTNEM UND
ICD KOMPONENTEN
........................................................................................
157
3.4.3 ULTRASTRUKTUR DER HERZMUSKULATUR 167
3.4.4 EXPRESSIONSANALYSE SARKOMERISCHER PROTEINE SOWIE
XIRP-INTERAKTIONSPARTNER..........................................................
.
.........................169
3.5 EINFLUSS DER XIRPS AUF DIE ENTWICKLUNG DER HYPERTROPHIE
DES
HERZENS..................................................................................................................
170
3.5.1 IMMUNFLUORESZENZMARKIERUNGEN AN ISOLIERTEN
KARDIOMYOZYTEN........................171
3.5.1.1 LOKALISATION SARKOMERISCHER
PROTEINE........................................................... 171
3.5.1.2 LOKALISATION VON ICD
KOMPONENTEN............................................................
172
3.5.1.3 MORPHOMETRISCHE ANALYSE DER KARDIOMYOZYTEN
.........................................
178
3.5.2 EXPRESSIONSANALYSEN SARKOMERISCHER PROTEINE SOWIE
XIRP-INTERAKTIONSPARTNER......................................................................................179
4.
DISKUSSION...........................................................................................................................
182
4.1 XIRPS IN DER
HERZMUSKULATUR......................................................................................
183
4.1.1
HERZMORPHOGENESE................................................................................................
183
4.1.2 ICD-REIFUNG UND
REMODELLIERUNG........................................................................186
4.1.3 KARDIALER STRESS UND
HYPERTROPHIE........................................................................188
4.2 XIRPS IN DER SKELETTMUSKULATUR
.................................................................................
192
4.2.1 XIRPS IN VERSCHIEDENEN SKELETTMUSKELN DER W
ILDTYP-MAUS............................192
4.2.2 MYOGENESE UND MORPHOLOGIE DER M
TJ................................................................194
4.2.3 HYPERTROPHIE DER
SKELETTMUSKELFASEM.................................................................198
4.2.4 REGENERATION UND
REMODELLIERUNG.......................................................................200
4.3
FAZIT..............................................................................................................................
205
5.
LITERATURVERZEICHNIS..........................................................................................................
206
ANHANG.........................................................................................................................................
I
A. MESSWERTTABELLEN
II
|
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